Molekularbiologische Forschungsmethoden und deren Verwendung

Molekularbiologische Untersuchungsmethoden spielen eine wichtige Rolle in der modernen Medizin, Forensik und Biologie. Dank der Fortschritte bei der Untersuchung von DNA und RNA, ist die Person in der Lage, die das Genom des Organismus bestimmen, den Erreger zu erforschen, um die gewünschten Nukleinsäure in einer Mischung von Säuren zu erkennen, usw.

Molekularbiologische Methoden. Was ist das?

Zurück in dem 70-80s des Wissenschaftlers war die erste zu entschlüsseln , das menschliche Genom. Dieses Ereignis gab den Anstoß für die Entwicklung der Gentechnik und Molekularbiologie. Studium der Eigenschaften von DNA und RNA hat dazu geführt, dass es nun möglich ist, diese Nukleinsäuren zur Diagnose von Krankheiten, Studie Gen zu verwenden.

Herstellung von DNA und RNA

Molekularbiologische Diagnoseverfahren erfordern Ausgangsmaterial: oft diese Nukleinsäure. Es gibt mehr Möglichkeiten, diese Substanzen aus den Zellen lebenden Organismen zu wählen. Jedes hat seine Vor- und Nachteile, und es soll berücksichtigt werden, wenn ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren in reiner Form zu wählen.

1. Herstellung von DNA von Marmur. Das Verfahren besteht in der Mischung aus Alkohol Substanzen Behandlung fällt resultierende reine DNA. Der Nachteil dieser Methode ist die Verwendung von korrosiven Substanzen, Phenol und Chloroform.

2. Isolierung von DNA auf dem Ausleger. Die wichtigste Substanz, die hier verwendet wird – ist Guanidinthiocyanat (GuSCN). Es fördert die Ablagerung von Desoxyribonukleinsäure auf spezialisierte Substrate, aus dem es anschließend durch einen speziellen Puffer gesammelt werden. GuSCN jedoch – ist ein Inhibitor des TCP, und sogar ein kleiner Teil des in den DNA abgeschieden wird, den Verlauf der Polymerase-Kettenreaktion beeinflussen, was wichtig ist, wenn sie mit Nucleinsäuren arbeiten.

3. Fällung von Verunreinigungen. Das Verfahren unterscheidet sich von den vorherigen dadurch, daß die Moleküle selbst nicht dehoksiribonukleinovoy Säure und Verunreinigungen abgeschieden werden. Um dies zu tun, verwenden Sie die Ionenaustauscher. Der Nachteil ist, dass nicht alle Substanzen absetzen können.

4. Massenscreening. Dieses Verfahren wird in Fällen verwendet, wenn Sie keine genauen Informationen über die Struktur des DNA-Moleküls haben müssen, und die Notwendigkeit, einige Statistiken zu bekommen. Der Grund hierfür ist, dass die Nukleinsäurestruktur kann beschädigt werden, wenn Detergentien Handhabung, insbesondere Alkalien.

Klassifizierung von Forschungsmethoden

Alle molekularbiologischen Methoden der Forschung werden in drei Hauptgruppen unterteilt:

1. Amplification (eine Vielzahl von Enzymen verwendet wird). Dazu gehören PCR – Polymerasekettenreaktion, die in vielen der diagnostischen Methoden eine wichtige Rolle spielt.

2. Neamplifikatsionnye. Zu dieser Gruppe von Verfahren zugeordnet ist, direkt mit der Arbeit von Nukleinsäuregemischen. Beispiele sind 3 Arten Blots, in situ-Hybridisierung usw.

3. Verfahren, die auf die Erkennung des Signals von dem Sondenmolekül, das an eine spezifische DNA oder RNA-Sonde bindet. Beispiel – Hybridisierungssystem Hybride Capture System Lösung (HC2).

Enzyme, die in der molekularbiologischen Forschung Methoden können verwendet werden,

Viele molekulardiagnostischen Techniken beinhalten die Verwendung von breiten Palette von Enzymen. Im Folgenden werden am häufigsten verwendet:

1. Restriktionsenzym – „Schnitt“ das DNA-Molekül an die notwendigen Teile.

2. DNA-Polymerase – synthetisiert ein doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure-Molekül.

3. Reverse Transkriptase (reverse Transkriptase) – verwendet, um DNA von einer RNA-Matrize zu synthetisieren.

4. DNA-Ligase – ist für die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen den Nucleotiden verantwortlich.

5. Exonuklease – entfernt Nukleotide von den Endabschnitten des Desoxyribonucleinsäure-Moleküls.

PCR – die grundlegende Methode der DNA-Amplifikation

Polymerase – Kettenreaktion (PCR) ist in der modernen Molekularbiologie weit verbreitet. Dieses Verfahren, bei dem ein einzelnes DNA-Molekül kann eine große Anzahl von Kopien (Amplifizieren Molekül) erhalten werden.

Die wichtigsten Funktionen von PCR:

– Diagnose von Krankheiten;

– Klonen von DNA-Segmenten, Gene.

Zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion die folgenden Elemente erfordert: anfängliche DNA-Molekül, eine thermisch stabile DNA-Polymerase (Taq bzw. Pfu), Desoxyribonukleotid Phosphaten (Quellen von Stickstoff-Basen), die Primer (2 Primer 1 DNA-Molekül), und sich ein Puffersystem, das dirigieren kann alle Reaktionen.

PCR besteht aus drei Schritten: Denaturierung, Primer-Annealing und Dehnung.

1. Denaturierung. Bei einer Temperatur von 94-95 Grad Celsius proshodit brechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Ketten des DNA, und als Ergebnis erhält man zwei einzelsträngigen Moleküle.

2. angelagerten Primer. Bei einer Temperatur von 50-60 Grad Celsius auftritt Beitritt Primer an dem Enden der einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküle gemäß der Art der Komplementarität.

3. Dehnung. Bei einer Temperatur von 72 Grad synthetisiert Tochter Doppel Desoxyribonukleinsäuremolekülen verseilt.

DNA-Sequenzierung

Molekularbiologische Untersuchungsmethoden erfordern oft die Kenntnis der Sequenz von Nukleotiden, die in einem Molekül der Desoxyribonukleinsäure. Zur Bestimmung des genetischen Codes sequenziert. Molekulare Diagnostik der Zukunft wird auf dem Wissen in der Bestimmung der menschlichen Sequenz gewonnen basieren.

Die folgenden Arten von Sequenzierung:

• Sequenzierung durch das Maxam-Gilbert;
• Sanger-Sequenzierung;
• Pyrosequenzierung;
• nanoporovoe Sequenzierung.