Die Fluoreszenzmikroskopie: Prinzipien des Verfahrens

Absorption und Reemission von Licht weiteren anorganischen und organischen Flüssigkeiten ist das Ergebnis der Phosphoreszenz oder Fluoreszenz. Der Unterschied zwischen den Erscheinungen ist die Dauer des Intervalls zwischen Absorption und Emission von Lichtfluss. Wenn die Fluoreszenz dieser Prozesse treten fast gleichzeitig, während Phosphoreszenz – mit einer gewissen Verzögerung.

historische Informationen

Im Jahre 1852 beschrieb der britische Wissenschaftler Stokes, erste Fluoreszenz. Er stellte einen neuen Begriff als Ergebnis der Experimente mit Flussspat, das rote Licht unter UV – Licht emittiert. Stokes bemerkte ein interessantes Phänomen. Es wird festgestellt, dass die Wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung ist immer größer als der Fluss des Anregungslicht.

Um die Hypothese im 19. Jahrhundert zu bestätigen gibt es viele Versuche gegeben. Sie zeigten, dass eine Vielzahl von Proben, die unter dem Einfluss von UV-Licht fluoreszieren. Unter den Materialien, die unter anderem gewesen Kristalle, Harze, Mineralien, Chlorophyll, Roharzneimittel, anorganische Verbindungen, Vitamine, Öle. Die direkte Verwendung von Farbstoffen für biologische Tests begann erst im Jahr 1930

Die Fluoreszenzmikroskopie: Beschreibung

Einige der Materialien, die in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts Studien zeigten eine hohe Spezifität. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Dank der Leistung, die durch Kontrastverfahren nicht erreicht werden konnte, wurde das Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie ein wichtiges Instrument in der biomedizinischen und biologischen Forschung. Ebenso wurden wichtige Ergebnisse erzielt, und für Materialien.

? Welche Vorteile bietet das Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie? Mit neuen Materialien ist möglich geworden, und die Auswahl von hochspezifischen Zell submikroskopischen Komponenten. Die Fluoreszenzmikroskopie können einzelne Moleküle erkennen. Eine Vielzahl von Farbstoffen ermöglichen die Identifizierung mehrerer Elemente gleichzeitig. Trotz der begrenzten räumlichen Auflösung der Beugungsgrenze der Ausrüstung, die ich wiederum hängt von den spezifischen Eigenschaften der Probe, die Identifizierung von Molekülen, unter diesem Niveau ist auch durchaus möglich. Verschiedene Proben nach der Bestrahlung zeigt Autofluoreszenz. Dieses Phänomen wird in Petrologie, Botanik, der Halbleiterindustrie weit verbreitet.

Features

Studieren tierischen Geweben oder Krankheitserreger oft kompliziert oder zu schwach oder sehr stark unspezifischen Autofluoreszenz. Jedoch erhält der Wert in Studien Einführung in die Werkstoffkomponenten bei einer bestimmten Wellenlänge angeregt und emittieren die notwendige Lichtströmungsintensität. Fluorochrome wirkt als Farbstoffe der unabhängig in der Lage zu Strukturen befestigt (sichtbar oder unsichtbar). So haben sie eine hohe Selektivität für das Ziel, und die Quantenausbeute.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Die Fluoreszenzmikroskopie ist seit dem Aufkommen von natürlichen und synthetischen Farbstoffen verwendet. Sie besaßen bestimmte Intensitätsprofile der Emission und Anregung und gezielt auf spezifische biologische Targets.

Identifizierung einzelner Moleküle

Oft unter idealen Bedingungen, können Sie ein separates Element glow registrieren. Dazu unter anderem ist es notwendig, eine ausreichend niedrige Rauschen des Detektors und der optischen Hintergrunds zu liefern. Fluoresceinmoleküls zum Scheitern aufgrund kann bis zu 300 Tausend Photobleichens emittieren. Photon. Bei 20% Sammlung Effizienz des Verfahrens und kann sie in einer Menge von etwa 60 Tausend registrieren.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Die Fluoreszenzmikroskopie auf Basis von Avalanche – Photodioden oder elektronische Multiplikation, konnten die Forscher das Verhalten einzelner Moleküle durch die zweite beobachten, und in einigen Fällen sogar Minuten.

Komplexität

Ein zentrales Thema für die Unterdrückung von optischem Rausch Hintergrund. Aufgrund der Tatsache, dass einige Autofluoreszenz viele der Materialien bei der Konstruktion von Filtern verwendet und Linsen aufweisen, wurden die Bemühungen von Wissenschaftlern in den frühen Stadien der Produktion von Komponenten orientiert, um eine geringe Fluoreszenz aufweisen. Allerdings haben nachfolgende Experimente zu neuen Erkenntnissen geführt. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Insbesondere wurde festgestellt , dass die Fluoreszenzmikroskopie, bezogen auf das Gesamt interner Reflexion, ermöglicht es einen niedrigen Hintergrund und eine hohe Intensität von Anregungslicht zu erreichen.

Mechanismus

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Die Prinzipien der Fluoreszenzmikroskopie, bezogen auf das Gesamt interner Reflexion ist die Verwendung von abklingenden Welle oder evaneszenten. Es tritt an der Grenze zwischen Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes. In diesem Fall geht der Lichtstrahl durch das Prisma. Es hat einen hohen Brechungsindex Parameter.

Das Prisma benachbart zu der wässrigen Lösung oder Glas mit niedrigem Parameter. Wenn ein Lichtstrahl auf sie unter einem Winkel, der mehr kritisch ist, wird der Strahl vollständig von der Grenzfläche reflektiert. Dieses Phänomen, das wiederum bewirkt, dass nicht weitergegeben Wellen. Mit anderen Worten, die das erzeugte elektromagnetische Feld durchdringt, in ein Medium mit einem niedrigeren Brechungsindex-Parameter auf einen Abstand von weniger als 200 Nanometer.

Die abklingende Welle Intensität des Lichts , würde ausreichen , um Fluorophore anzuregen. Da jedoch die extrem geringen Tiefe, wird sein Volumen sehr klein sein. Das Ergebnis ist ein Low-Level-Hintergrund.

Modifikation

Fluoreszenzmikroskopie wird auf innerer Totalreflexion basieren, können mit Epi-Beleuchtung durchgeführt werden. Dies erfordert, Linsen mit hoher numerischer Apertur (mindestens 1,4, aber es ist wünschenswert, dass sie 1,45-1,6 erreicht), und teilweise Feldgerät beleuchtet. Letztere ist mit einem kleinen Punktgröße erreicht. Für größere Gleichförmigkeit mit einem dünnen Ring, der durch einen Teil des Stroms blockiert ist. Für den kritischen Winkel, wonach es eine Totalreflexion ist, müssen wir eine hohe Brechungs des Immersionsmediums in der Linse und dem Deckglas des Mikroskops.